ELISPOTアッセイ：原理、バリアント、応用と限界

基本原理とワークフロー

典型的なELISPOT実験では、標的分子に結合する捕捉抗体を、膜底プレートにあらかじめコーティングする。生存細胞を加えて培養し、分泌タンパク質を各分泌細胞の直近に捕捉する。細胞および未結合物質を洗浄除去した後、酵素結合検出抗体を添加し、発色基質を加える。これにより、捕捉部位に不溶性の有色沈殿が生じる。各沈殿はスポットとして現れ、通常は1個の分泌細胞、または近接する分泌細胞の集団に対応する。主な工程は以下のように要約できる。

• 捕捉抗体によるプレートのコーティング
• 細胞の培養および必要に応じた刺激
• 洗浄と検出抗体の添加
• 酵素反応による発色とスポット形成
• スポットの計数（手作業または自動）

バリアントと技術的詳細

ELISPOTプレートには、結合したタンパク質を保持するため、一般にニトロセルロース膜またはPVDF膜が用いられる。バリエーションには、インターフェロンガンマを対象とするIFN-γ ELISPOT、抗体分泌細胞を測定するB細胞／抗体ELISPOT、蛍光標識を用いて同一細胞由来の複数の分析対象物を検出する多重FluoroSpotアッセイがある。自動化装置や画像解析ソフトウェアにより、スポット数、サイズ、強度を定量できる。多くの研究室では、サイトカイン資料および抗体アッセイの資料集にある機器ガイドやプロトコルを参照する。

応用と重要性

ELISPOTは高感度で必要細胞数が少ないため、免疫モニタリングに広く用いられている。主な用途には、ワクチン接種後のT細胞応答の評価、感染症およびワクチン研究におけるB細胞応答または抗体分泌細胞の測定、免疫療法の臨床試験における免疫応答の評価が含まれる。単一細胞レベルの感度により、バルクアッセイでは見逃される可能性のある、まれな抗原特異的細胞を検出できる。末梢血単核細胞（PBMC）を用いる実践例については、血液細胞アッセイの資料を参照。

利点と限界

ELISPOTの利点は、単一の分泌細胞を検出できる高感度、定量的なスポット計数、一部の細胞ベースアッセイと比べた場合の相対的な簡便さである。一方、並行アッセイと組み合わせない限り表現型情報が失われること、生細胞と適切な刺激プロトコルに依存すること、大きなスポットまたは融合したスポットの解釈が曖昧になり得ることが限界である。FluoroSpotの利用、ならびにELISPOTと細胞ソーティングまたはフローサイトメトリー技術の組み合わせは、こうした限界の一部に対処するのに役立つ。

歴史的背景と実務上の考慮事項

ELISPOTは1980年代初頭に、イムノアッセイの原理を単一細胞解析へ実用的に応用した手法として登場した。その後、膜、試薬、画像解析ツールの改良とともに発展してきた。ELISPOT研究を設計または解釈する際の重要事項には、捕捉抗体および検出抗体の選択、ウェル当たりの細胞数、刺激条件、適切な対照、スポット計数法がある。再現性のある結果と研究間で意味のある比較のためには、適切な対照と標準化されたプロトコルが不可欠である。

関連項目：IFN-γ ELISPOT、B細胞ELISPOT、FluoroSpotなどのアッセイのバリアント、および、より広範な免疫学的評価のためのELISAや細胞内サイトカイン染色などの比較手法。