概要
薄層クロマトグラフィー（TLC）は、薄い吸着層を塗布した平らな不活性支持体上で、混合物の成分を分離するシンプルで迅速な実験室手法である。これは吸着クロマトグラフィーまたは分配クロマトグラフィーの平面型であり、固定相はコーティングされた層、移動相は液体で、毛細管現象によって表面上を移動する。各成分は固定相への親和性と移動相への溶解性の違いに応じて異なる速度で移動し、明瞭なスポットとして現れて比較できる。
固定相と移動相
- 固定相: 一般には、ガラス、アルミニウム、またはプラスチックの支持体上にシリカゲル、アルミナ、セルロースなどを均一に塗布したものが用いられる。プレートは特定の分離に合わせて前処理、活性化、含浸処理されることがあり、検出を助けるために蛍光指示薬を含むものもある。
- 移動相: 分析対象物質と固定相に対する極性を考慮して選ばれる単一溶媒、または混合溶媒である。正相TLCでは、シリカのような極性固定相と比較的非極性の溶媒を用い、逆相TLCでは、C18のような非極性被覆とより極性の高い溶媒を用いる。
手順
典型的な手順は、カピラリーやマイクロピペットで試料をプレート下端付近に小さく濃縮してスポットすることから始まる。次に、浅い層の溶媒を入れた密閉開発槽にプレートを立て、溶媒前線が所定距離まで上昇するまで展開する。その後、プレートを取り出して乾燥し、分離された成分を可視化する。保持因子（Rf）は、化合物が移動した距離を溶媒前線が移動した距離で割って求める。Rf値は再現性のある比較指標になるが、溶媒組成、吸着剤、スポットの大きさ、濃度、温度に左右される。
可視化と検出
- 多くのプレートには蛍光指示薬が含まれ、短波長（254 nm）または長波長（365 nm）のUV光の下で観察できる。ある種の化合物は蛍光を消光し、暗いスポットとして見える。
- UVで見えにくい化合物を明らかにするために、化学染色剤や誘導体化試薬が用いられる。代表例として、ヨウ素蒸気、アミン用のニンヒドリン、過マンガン酸カリウム、アニスアルデヒド、バニリン、リンモリブデン酸などがある。
- スポットの強度比較やデンシトメトリーにより半定量分析が可能である。現代の研究室では、TLCを質量分析に連結したり、分取TLCの後に溶出して分析したりすることもある。
応用
TLCは、小規模分離や日常分析に広く使われている。反応進行の追跡、純度確認、標準試料との比較による化合物の同定、小規模な分取分離などに有用である。低コストで、迅速に行え、必要な試料量と溶媒量が少なく、教育・研究の両方の実験室で扱いやすい点が評価されている。
限界と比較
スクリーニングや定性的分析には非常に有用だが、TLCの分解能と定量精度は、一般にカラムクロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー（HPLC）、ガスクロマトグラフィー（GC）より低い。確実な同定や精密な定量が必要な場合、TLCの結果は、より高感度な機器分析法で確認されることが多い。
実務上の注意点と安全性
- 効果的な溶媒系の選定には試行錯誤が必要なことが多い。一般には、非極性成分から極性成分まで性質の異なる組み合わせを変えて分離条件を調整する。
- 操作では、プレート表面を汚染しないこと、スポットを小さく高濃度に保つこと、そしてRfを正確に計算できるように溶媒前線を乾燥前に記録することが重要である。
- 安全面では、使用される有機溶媒の多くが揮発性で可燃性であるため、ドラフト内で作業し、適切な保護具を用いる。シリカなどの微細な吸着剤粉末は吸入の危険があるので、粉じんを生じさせないようにし、使用済みプレートや溶媒は規則に従って廃棄する。
トラブルシューティングと補足
分離が不十分な場合、原因としては試料の載せすぎ、不適切な溶媒極性、不純な固定相、汚染された開発槽などが考えられる。再現性は、市販の前塗布プレート、自動スポッティングや開発システム、温度と湿度の制御によって改善できる。分取TLCでは、より大きなプレートと多めの試料を用い、分離したバンドを削り取って吸着剤から抽出し、精製物を回収する。