ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）：原理、歴史、応用

基本構成要素と基本的な仕組み

一般的なPCRには、標的配列を含む鋳型、目的領域を挟む2本のプライマー、デオキシヌクレオチド三リン酸（dNTP）の供給源、新しい鎖を合成できるDNAポリメラーゼという4つの基本要素が必要である。標的となる基質についての簡潔な説明は、DNAを参照されたい。鋳型のコピーを担う酵素はDNAポリメラーゼであり、通常は後述する耐熱性の型が用いられる。

この反応は、主に3段階から成るサイクルを繰り返して進む。すなわち、二本鎖の鋳型を分離するための加熱である変性、プライマーを相補的な部位に結合させるための冷却であるアニーリング、そして各プライマーからポリメラーゼが新しいDNAを合成する伸長である。新たに作られたコピーも後続サイクルでは鋳型となるため、効率的な条件下では産物は指数関数的に蓄積する。

手法の変法

当初のプロトコルが考案されて以降、多くの特殊化されたPCR法が開発されてきた。一般的な変法には、次のものがある。

• 逆転写PCR（RT-PCR） — 増幅前にRNAを相補的DNA（cDNA）へ変換し、RNA配列の検出および定量を可能にする。
• 定量PCR（qPCRまたはリアルタイムPCR） — サイクル中の産物蓄積を測定し、出発時の鋳型量を推定できる。
• デジタルPCR — 試料を分割して多数の独立した反応で増幅を行い、精密な絶対定量を可能にする。

歴史的背景と発展

現代的なPCRの実用的手順は1980年代初頭に確立され、1983年にキャリー・マリスによって報告された。重要な進歩は、好熱性細菌から単離した耐熱性ポリメラーゼの使用であり、これにより自動化された温度サイクルが実用的になった。この貢献によりマリスは1993年にノーベル化学賞を受賞した。同年には、分子生物学における関連研究により、別の研究者であるマイケル・スミスも顕彰された。

一般的な酵素と実用上の留意点

Thermus aquaticusなどの生物に由来することが多い耐熱性ポリメラーゼは、各サイクルで新たな酵素を加えることなく、反応液を繰り返し加熱することを可能にする。これらの耐熱性酵素は、変性に用いる高温で安定しており、伸長に必要なより低い温度でも活性を示す。PCRの成功は、慎重なプライマー設計、適切なマグネシウムおよび塩の濃度、さらに生物学的試料に含まれうる阻害物質を避けることにも左右される。

用途、重要性、限界

PCRは、分子生物学およびその応用分野における基盤的技術である。遺伝子のクローニング、シーケンシング用鋳型の調製、臨床診断における感染性病原体の検出、遺伝的変異の解析、法医学試料や環境試料からのDNA回収に使用される。qPCRなどの変法は、遺伝子発現量やウイルス量の測定において中心的な役割を果たす。一方で、PCRはごく微量の混入DNAでも増幅されうるため、汚染の影響を受けやすい。したがって、厳格な対照実験と適切な実験室実務が不可欠である。また、PCRで増幅できるのはプライマーによって規定される領域に限られるため、事前の配列情報または設計が必要となる。

特徴と注目すべき事実

PCRは、人工的な反復温度制御と、増幅範囲の境界を定める短いプライマーの使用という点で、自然界のDNA複製と主に異なる。この技術は、選択した配列を迅速かつ特異的に増幅することを世界中の実験室で日常的に実施可能とし、生物学を変革した。PCRをより広い文脈で捉える分子生物学および実験室実務の入門としては、一般的な生化学的手法の資料を参照できる。

総じて、PCRは適応性が高く、広く利用され続けている手法である。より高速な酵素、ホットスタート製剤、改良された定量法などの継続的な改善により、初期の限界の一部に対応しながら、その応用範囲は拡大している。